Neste exemplo, um gene da biblioteca de genes de mamíferos será subclonado em um plasmídeo bacteriano (plataforma de destino). O plasmídeo bacteriano é um pedaço de DNA circular que contém elementos reguladores que permitem que a bactéria produza um produto gênico (expressão gênica) se for colocado no local correto no plasmídeo. O local de produção é flanqueado por dois locais de corte de enzima de limitação "A" e "B" com extremidades adesivas incompatíveis.
O mamífero DNA não vem com esses locais de limitação, então eles são construídos por extensão de sobreposição PCR. Os primers são projetados para colocar os locais de limitação cuidadosamente, de modo que a codificação da proteína esteja dentro da estrutura e um mínimo de aminoácidos extras seja implantado em cada lado da proteína.
Tanto o produto PCR contendo o gene de mamífero com os novos locais de limitação e o plasmídeo de destino são submetidos à digestão de limitação e os produtos digeridos são purificados por gel electrophoresis .
Os produtos de digestão, agora contendo extremidades coesivas compatíveis entre si (mas extremidades coesivas incompatíveis entre si) são submetidos à ligação, criando um novo plasmídeo que contém os elementos de fundo do plasmídeo original com uma inserção distinta.
Imagem 274A | Esta imagem subcloning mostra o procedimento de subcloning conforme descrito à esquerda. | O uploader original foi o Takometer na Wikipedia em inglês. / Attribution 2.5 Generic | Page URL : (https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Subcloning.png) from Wikimedia Commons
Autor : Yavor Mendel
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